Von Michael Breu

Das Auge ist das wichtigste Sinnesorgan des Menschen: kein anderes liefert so viele Informationen an das Gehirn. Sehr kleine Gegenstände sieht man von blossem Auge noch – ein zehntel Millimeter (100 Mikrometer) ist im Abstand von etwa 20 Zentimeter noch knapp erkennbar. Wer kleinere Gegenstände untersuchen will, etwa Zellen, benutzt ein Lichtmikroskop. Damit lassen sich Strukturen abbilden, die ein tausendstel Millimeter (1 Mikrometer) klein sind. Noch kleinere Strukturen – zum Beispiel die Erbsubstanz DNA oder Kristalle – lassen sich mit dem Lichtmikroskop nicht untersuchen, dazu verwendet man Elektronenmikroskope (EM).

Präparation, der limitierende Faktor

Das Prinzip ist vergleichbar: Anstatt eine Licht- besitzt das EM eine Elektronenquelle, eine glühende Wolfram-Spitze. Die emittierten Elektronen werden anstatt von einer Linse durch Magnetfelder gebündelt und durch die Probe geschickt. Ein stark vergrössertes Bild erscheint dann auf einem Leuchtschirm oder bei modernen Geräten auf dem Computermonitor. Mit den besten Geräten erreicht man heute eine Auflösung von etwa 0,1 Nanometer (millionstel Millimeter). Zum Vergleich: die Bindungslänge zwischen zwei Atomen beträgt etwa 0,2 Nanometer!

„Der limitierende Faktor ist nicht die Auflösung des Elektronenmikroskops, die ist wirklich hervorragend. Der limitierende Faktor ist die Präparationstechnik“, sagt José M. Sogo, der am ETH-Institut für Zellbiologie (1) seit mehreren Jahren die Elektronenmikroskopie für seine Forschung anwendet. Sogo untersucht den Kopiervorgang, die Replikation von DNA; ihn interessieren dabei vor allem die dynamischen Prozesse – was sich zu welcher Zeit beim Kopierprozess abspielt. Dabei hat er in den letzten Jahren mehrfach wichtige Erkenntnisse gewonnen, etwa über fehlerhafte Kopien von Plasmiden (die zu einem Knoten in der Erbsubstanz führen) oder über einen vorzeitigen Abbruch des Kopierprozesses (was zur Genominstabilität führt).

Die DNA eines sich replizierenden SV-40-Minichromosoms: Der parentale Strang und die neu replizierten Tochterstränge sind als einsträngige Blasen dargestellt. Bild: José Sogo gross

Die Arbeit von José Sogo beginnt am Fermenter. Dort werden Zellkulturen vermehrt, „etwa ein Liter ist nötig“, sagt der gebürtige Spanier. Diese werden dann zentrifugiert, angereichert und mit Psoralen versetzt. Der Naturstoff bindet unter Einwirkung von UV-Licht an die Nucleinbasen der DNA (cross-linking). Die so gestoppte Zellteilung wird nun weiter untersucht. Dazu muss die Erbsubstanz isoliert und aufwendig gereinigt werden. Schliesslich liegen nach etwa drei Wochen Arbeit knapp fünf Mikroliter (millionstel Liter) der gewünschten Nukleinsäure vor in einer Reinheit von maximal 50 Prozent. Daraus werden nun 0,7 Mikroliter mit einer Eppendorfer-Pipette in ein Röhrchen gegeben, mit 0,5 Mikroliter Formaldehyd/Glyoxal versetzt (Denaturierung) und schliesslich bei 45 Grad Celsius im Wasserbad erwärmt. „Dann kommt ein interner Standard hinzu und etwas Detergent“, erklärt José Sogo. Nun muss die Probe auf sieben bis acht kleine Kupfernetzchen gebracht und anschliessend zur Kontrastierung mit einem Platin-Kohlenstoff-Gemisch bedampft werden.

Kopiervorgang abgebrochen

Dann ist sie bereit für die eigentliche Untersuchung. José Sogo reicht eines der ältesten Elektronenmikroskope der ETH – ein Philips EM 420, ein vor zwanzig Jahren gekauftes Gerät: „Um biologische Informationen lesen zu können, reicht eine Auflösung von 2 bis 3 Nanometern“, sagt er. Das dunkelgrüne Gerät startet, die Vakuumpumpen saugen die Apparatur leer. Nun wird die Wolfram-Spitze aufgeheizt, und Licht auf dem fluoreszierenden Bildschirm bestätigt, dass Elektronen emittiert werden. Das Elektronenmikroskop ist bereit. Eines der Kupfernetzchen wird nun auf den Probenhalter gebracht und vorsichtig in die Apparatur eingebracht. Das fluoreszierende Grün des vergrösserten Bildes auf dem Fluoreszenzschirm wird mit einem Lichtmikroskop abgesucht – und tatsächlich: Die Hefezelle mit der fehlenden rad53-Kinase hat den Kopiervorgang abgebrochen, unter dem EM ist es deutlich sichtbar.

Auseinanderlaufende Metalle

Ebenfalls mit der Elektronenmikroskopie befasst sich Helge Heinrich vom ETH-Institut für Angewandte Physik (2). Er untersucht derzeit, wie die einzelnen Metallatome aus der bei hohen Temperaturen unbeständigen Legierung Gold-Nickel „auseinander laufen“ und stellenweise wieder reine Elemente bilden. Dazu hat er eine hauchdünne Probe vorbereitet und sie auf den Probenhalter gespannt. Verglichen zu Sogos biologischen Proben braucht Heinrich eine deutlich bessere Auflösung – das Kristallgitter der Legierung sollte mindestens sichtbar sein. Er wählt deshalb ein Tecnai F30, das modernste Gerät von Philips.

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